先把名称理清楚，因为这个领域的术语本身就在打转。所谓 dark proteome（暗蛋白质组），最早其实借自结构生物学——指晶体结构和冷冻电镜都解析不出来的那一大片”结构上黑暗”区域。随着解析手段进步，这个词渐渐被挪了个位置，现在一般指基因组注释盲区里那些被遗漏的基因产物：非编码 RNA 内部、5′UTR 与 3′UTR、假基因里的隐蔽开放阅读框（ncORF）所翻译出来的东西。而 microprotein、smORF-encoded protein（SEP）、translated smORF 这几个说法，基本指同一类——长度短于 100 个氨基酸（更多时候收紧到 50）、以往直接被注释流程忽略掉的小蛋白。值得留意：今年五月发表在 Nature 的 TransCODE 联盟工作提出来的一个新词：peptidein[1]。这个词的功能，是在”明确有功能的蛋白”和”纯噪音”之间，为一类确实被翻译了、也确实在质谱里被检出了、但功能尚不明确的基因产物安放了名分。它既是科学概念，也是一次数据库治理上的善意让步——下文还会回到这一点。
那么它为什么值得关注。人类蛋白质组的注释向来是这场游戏的基准线：GENCODE 目前收录大约 19,500 个带功能证据的蛋白编码基因，而转录组测序却告诉我们，超过七成的人类基因组都在转录。这两者之间的巨大落差，就是暗蛋白质组被反复追问的起点。TransCODE 的工作把”到底有多少隐蔽 ORF 真的做出了蛋白”这件含糊事，用数字钉死了一部分：他们挑了 7,264 个 ncORF，回看 95,520 个蛋白质组学实验的存量谱图——据称约 37 亿个谱、耗时约两万小时计算——结果约四分之一（1,785 个）能检出可重复的肽段；这 1,785 个里，65% 短于 50 个氨基酸，与 19,500 个经典蛋白里不到 1% 的短序列比例形成鲜明对比[1]。意义不止在数量。OLMALINC 这个长链非编码 RNA 来源的 peptidein，在超过 485 个癌细胞系里被大范围 CRISPR 敲除后，有 85% 出现生存受损，敲除效应被证实来自肽本身而不是承载它的 RNA[1]。更关键的免疫学落点：不少新检出的 peptidein 会被 MHC 呈递到细胞表面，等于天然成了癌症免疫治疗的候选靶标[1]。这一切如果展开，是”人类基因组编码蛋白质的容量被系统性低估”的又一次实证。
我此前评过一篇同一浪潮的病毒侧工作，或许能补一个参照。那篇是 Chen-Neumann 等人关于病毒微蛋白的 pan-viral 功能图谱：从 52,979 个推算的病毒 smORF 里，最终确认超过 2,000 个在 Perturb-seq 中表型活跃，聚成 24 个功能簇、433 个 smORF，另有 752 个独行侠式的 singletons[2]。它最漂亮的一处，是发现不同源的病毒小蛋白会”殊途同归”：人乳头瘤病毒的 E7 癌蛋白与腺病毒的 E4 ORF6/7，氨基酸序列毫不相干，却在转录表型和 Rb–E2F 复合物互作上一起汇合，共同推动 S 期进入[2]。这段结论用序列同源或结构同源的常规管线根本抓不住，必须先有”表型先行”的筛选。把它和 TransCODE 放在一起看，这波暗蛋白质组研究的味道就很清楚了——同一套方法学，一边挖人自身的隐蔽 ORF，一边挖病毒的隐蔽 ORF，两边互相印证这个被长期忽略的世界确实存在。
那么，基本研究思路是什么。在我看来，整个领域可概括成一架”证据阶梯”，每一级都有它各自的假阳性来源，而公认好的工作都在努力把每一级都铺实。第一级是序列注释——基因里确实存在一个可读框；这一步几乎每个随机序列都会吐出大量短 ORF，所以单纯”序列里有 ORF”没有任何说服力。第二级是转录证据——这段 RNA 确实转录出来，可能只有特定细胞状态、特定条件下才有，低丰度是常态。第三级是翻译证据，这是关键分水岭，靠核糖体图谱（Ribo-seq）的典型 3-核苷酸周期性来确定起点和翻译活性，衍生出 ORF-RATER 这类起始位点评分工具，用来区分真实的翻译起始与再起始的模糊地带[1]。第四级是蛋白存在证据，核心是质谱——构建包含 ncORF 的定制数据库、在统一的错误发现率框架下做搜库，这正是 TransCODE 用存量谱图档案（PeptideAtlas、PRIDE）规模化重搜的价值所在[1]。第五级是功能，用 CRISPR 敲除、Perturb-seq、以及”罪证关联”式的表型聚类，把匿名 ORF 赋予职责；病毒那篇的故事就发生在这里。第六级才是机制——互作伙伴、结构、生化，靠亲和富集质谱（AE-MS）、AlphaFold、冷冻电镜去落地。一句话，从”序列”到”机制”，彼此之间隔着五道独立的证据门，任何一篇号称发现了新的 microprotein 的工作，都应当说清楚自己站在第几级。
那么新型组学技术在这架阶梯上各自能做什么。这大概是这波研究最实际的地方：它不是靠某一种革命性方法，而是靠一整套互补技术的叠加才被撬开的。核糖体图谱解决”哪里在翻译”，让研究者不必依赖蛋白检测就能圈定候选 ORF[1][2]。谱图档案的规模化重搜加上蛋白基因组学数据库，解决”哪些真的成了蛋白”——这是把过去十年积累的旧数据变成新发现的矿，TransCODE 把 GENCODE 与 PeptideAtlas 做成公开资源，正是为了这一点[1]。仪器层面的进步则是质谱科学家的主战场：像 Orbitrap Astral 这一代高分辨高灵敏设备，对微蛋白这类”又小、又往往低丰度”的目标是质的变化——肠道菌群 smORF 蛋白在一篇预印本里，无需专门的大小富集，就能在宏蛋白质组中检出超过 30,000 条 SEP[4]，这放在上一代仪器上难以想象；DIA 与靶向 PRM 又让验证不必依赖抗体——而微蛋白太小，传统抗体几乎无从下手，这一条格外重要。免疫肽组学则提供了另一条”可见性”路径：MHC 呈递让沉默的微蛋白在免疫层面显形，成为免疫治疗的靶标，TransCODE 的作者名单里就有 Bassani-Sternberg 与 Ternette 两位免疫肽组学的领军者[1]，而笔者此前评过的自身抗原 SERPINB3 一文用的正是同一套方法[5]。功能端则靠 Perturb-seq 与 AE-MS、结构预测去续上最后两级。
说一点冷静话。暗蛋白质组首先是检测问题，然后才是生物学问题，而检测问题在微蛋白上格外尖锐。体量小，胰酶切出来的肽段就少，一个蛋白往往只剩一两条可用的特征肽，这意味着谱图层面的识别证据很薄；数据库一旦混入几万个短 ORF 条目，目标-诱饵（target-decoy）的错误发现率估计会被高估，靠肽段计数来判定存在与否，极易在”多肽”与”噪声”之间摇摆[3]。TransCODE 把重心放在谱图层面的审校（curation）而不是简单堆叠肽计数，正是在回应这一点[1]。另一层要诚实的是方向性偏差：1,785 只是 7,264 的四分之一，剩下四分之三没检出——这既可能是真实的”不存在翻译产物”，也很可能只是灵敏度与动态范围的局限，属于”无证据”而非”证据为无”。反过来，检出的也并非全都可靠，单肽鉴定与小库 FDR 的偏差都是实打实的风险。这种双刃剑，也正是 peptidein 这个概念的深层价值——它不假装一个检出的小肽就是功能蛋白，而是坦承”存在，但功能未定”，给未来留下升格为”蛋白”的通道[1]。
把它放到更大的图景里，这波暗蛋白质组的热度，与当年肿瘤新抗原领域走过的路径惊人地相似：先花大力气把”存在”论证扎实，功能和转化再分层兑现。如今新抗原已经让个体化肿瘤疫苗走向临床，而暗蛋白质组的淘金才刚刚开始。我们手里的灵敏度、覆盖深度和 FDR 控制，正从”锦上添花”变成这个领域的瓶颈本身。而它所指向的问题，也已经不只是”基因组里还有多少隐藏的蛋白”，而是”我们该如何重新定义蛋白质组的边界”。2026 年，GENCODE 已经开始收录 peptidein 注释。若干年后回望，这大概会被记成：人类蛋白质组的边界，在这一年被规模化地改写。
术语对照
| 术语 | 含义 | 备注 |
|---|---|---|
| Dark proteome | 基因组注释盲区编码、以往被遗漏的基因产物 | 来源词原指结构未解析区域，现已转义 |
| ncORF | 非经典开放阅读框，位于 lncRNA、UTR、假基因等 | 研究的基本单元 |
| Microprotein / SEP | 短于约定长度（常小于100 aa）的翻译产物 | 描述性宽泛称谓 |
| Peptidein | 有翻译与检测证据、但功能未定的基因产物 | TransCODE 提出的第三类 |
| ORBL | ORF 相对分支长度，一种进化约束度量 | 用于筛选有生物学价值的 ORF |
| Ribo-seq / Perturb-seq | 核糖体图谱 / 单细胞扰动测序 | 分别定”翻译”与”功能” |
参考文献
[1] Deutsch EW, Kok LW, Mudge JM, et al. Expanding the human proteome with microproteins and peptideins. Nature 654, 813–825 (2026). doi:10.1038/s41586-026-10459-x
[2] Chen-Neumann YH, et al. The diverse functions of viral microproteins. bioRxiv 2026.08.23.746553 (2026).（笔者此前已作评述，见评病毒微蛋白的pan-viral功能图谱）
[3] Perdigão N, et al. Unexpected widespread exposure of conserved protein regions to protein degradation. Structure (2015).（暗蛋白质组概念早期来源之一，供参考）
[4] Expanding the human metaproteome: enhancing smORF prediction and ultra-deep detection of smORF-encoded proteins in the gut microbiome. Research Square (2026).（以 Orbitrap Astral 检出 >30,000 条 SEP 的预印本）
[5] Jargosch M, et al. Sci Adv 2025, eadx0637.（自身抗原 SERPINB3 免疫肽组学工作，笔者已作评述，见评免疫肽组学在银屑病中挖出的自身抗原SERPINB3）
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