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肿瘤新抗原的鉴定长期依赖新鲜冰冻组织，但临床上组织有限、取样有创，液体活检因此被视为一条更友好的路径。既往研究已从血浆中鉴定到大量野生型HLA配体，甚至包括肿瘤相关抗原（TAA）来源的肽段，这让人自然期待：能否直接从血浆免疫肽组学中发现突变来源的新表位[1]？9月底发表于bioRxiv的一项工作给出了迄今为止最诚实的边界评估：Riemer与Berghoff团队联合DKFZ和维也纳医科大学，对4例脑转移实体瘤患者同步采集血浆与肿瘤组织，用DIA-FAIMS质谱系统比较了cfDNA与肿瘤组织DNA（tgDNA）分别指导的新表位检索，结论是——血浆免疫肽组学在原则上可行，但目前仍卡在cfDNA变异检出与质谱灵敏度两个环节[1]。
研究的实验设计本身值得肯定。4例患者覆盖小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌与黑色素瘤，各配对的转移灶新鲜冰冻组织与动脉血浆在24小时内采集；同时纳入4名健康献血者作为血浆对照。所有样本经W6/32抗体免疫沉淀富集HLA-I复合物，在Thermo Exploris 480上采用FAIMS接口以两个补偿电压进行DIA采集，检索使用Spectronaut、PEAKS与FragPipe三套引擎，并以NeoDisc进行基于变异 calling 的新表位预测；候选肽还经过HLA Ligand Atlas等良性参考库过滤，以剔除常见人类肽段[1][6]。在变异的DNA层面，作者同时用Sarek、NeoDisc、Needlestack与cfSNV四种caller处理cfDNA与tgDNA，再用合成稳定同位素标记肽（SIL）做谱图匹配验证，最后以健康供者HLA配型PBMC检测免疫原性。这种多引擎、多caller、多验证层的设置，使阴性结果更难被简单归结为技术路径选择不当。
血浆免疫肽组学的第一个好消息来自野生型配体。患者血浆平均鉴定到约6,780条独特野生型HLA-I配体，与配对组织的约9,871条在数量级上接近；患者平均有58%的配体在血浆与组织间共享，而91%的血浆配体可在组织中被重新发现。肽段长度分布以9-mer为主（约69%），HLA-A/B/C的预测结合比例符合预期，DeepLC保留时间预测与实验值的相关性ρ≥0.94，说明数据质量本身经得起审视。更有意义的是，研究者在血浆中检出了15条来自11个已知TAA的配体，其中13条在配对组织中复现，包括MAGE-A10等癌睾抗原；这证明血浆确实能承载肿瘤来源的HLA呈递信息[1][2]。
然而，一旦进入突变指导的新表位检索，瓶颈立即显现，而且第一个瓶颈不在质谱，而在变异 calling。cfDNA检出的非 synonymous 变异数量（平均839个）反而高于tgDNA（平均751个），但两者重叠仅约15%；即便经过读数支持、链偏倚与多caller共识等严格人工过滤，重叠也仅从15%提升到20%，且只稳定出现在两名患者中。更棘手的是，健康对照的cfDNA中也检出大量非 synonymous 变异，过滤前总数达1,773个，过滤后仍有36个，提示血浆游离DNA中的克隆性造血或测序假象会严重干扰肿瘤突变特异性[1][3]。
这一DNA层面的 discordance 直接传递到质谱结果：以cfDNA突变组为参考数据库，在血浆中未验证到任何新表位；5个通过in silico NSA初筛的候选肽，经SIL肽谱图比对后均因NSA<0.7或匹配片段数不足而被排除。作者转而用tgDNA突变组作为补充参考，才在1例小细胞肺癌患者血浆中鉴定到两条新表位（GSLQPLPPR来自MMAB错义突变，SGAPPAPAAR来自INSM1移码突变），但都处于检测极限：GSLQPLPPR在血浆中仅5个独特转换、NSA 0.7，SGAPPAPAAR虽NSA 0.82却只有4个转换，且两者在组织中的信号明显更强[1]。配对组织样本进一步鉴定出另外3条组织独占的新表位，其中2条（RTSLAALQL、KVSSIFFINK）能在HLA配型健康供者PBMC中诱导IFN-γ与TNF-α双阳性CD8+ T细胞反应，而血浆检出的两条则未能在同批供者中激发可检测反应[1]。
从笔者的角度看，这项工作的价值恰恰在于它没有为了“成功”而放低证据标准。作者本可以像许多研究那样，把cfDNA预测出的几十个突变肽直接称为“候选新抗原”，但他们坚持用刀片式的SIL验证和免疫原性实验，结果把故事推向了另一个方向：血浆免疫肽组学足够好地反映了肿瘤组织的野生型呈递景观，却无法绕过cfDNA变异检出与MS检测灵敏度的双重约束。
这一结论与当前技术边界高度吻合。血浆中的sHLA-肽复合物本身浓度低、半衰期短，且血浆采样在本研究中发生在脑转移灶切除之后，肿瘤负荷与ctDNA释放可能已显著下降；平均16 mL血浆、单次DIA-FAIMS采集、无可用的PRM spike-in验证，这些样本与仪器条件已经把分析推到了灵敏度边缘。从质谱方法论的角度，FAIMS-DIA在 Exploris 480 上是成熟的免疫肽组学平台，但要稳定检测血浆中的低频突变肽，需要更高灵敏度的仪器（如Orbitrap Astral、timsTOF或新一代离子阱高分辨平台）、更大体积的血浆富集、更长时间的色谱梯度，以及针对候选肽的targeted PRM/SL-SWATH验证，而不是依赖DIA单次全扫的偶然捕获[1][4]。
同时，cfDNA突变组与tgDNA的低一致性也提醒我们：液体活检的“突变信息”并不天然等于“肿瘤的突变信息”。ctDNA在总cfDNA中的占比低，克隆性造血、白细胞来源DNA和测序假象共同构成背景噪声，而现有caller在低VAF区间的表现差异巨大。本研究中，tgDNA验证的5条新表位里，有2条在常规过滤标准下会被排除——这反过来也说明，若以cfDNA为唯一参考，不但会漏掉真阳性，还可能引入大量假阳性[1][5]。
| 指标 | 血浆 | 配对肿瘤组织 |
|---|---|---|
| 样本量/体积 | 4例患者，平均约16 mL动脉血浆；4名健康对照 | 4例脑转移灶新鲜冰冻组织 |
| 野生型HLA-I配体数 | 约6,780（范围3,339–10,525） | 约9,871（范围6,987–14,224） |
| 与配对来源的重叠 | 58%与组织共享；91%血浆配体在组织中复现 | — |
| TAA来源配体 | 15条（13条在组织中复现） | 42条 |
| cfDNA–tgDNA变异重叠 | 默认过滤约15%；人工严格过滤后约20% | 作为参考标准 |
| 经验证的新表位 | 2条，1例患者，处于MS检测极限 | 5条，3例患者；其中2条可诱导T细胞反应 |
上表概括了血浆与组织作为免疫肽组学来源的核心差异。野生型层面的高度一致性为血浆用于TAA监测或疫苗疗效追踪提供了依据；但新表位层面的巨大落差说明，突变检出与肽段丰度构成了目前无法拆开的连环扣。
这项工作也为未来的方法优化指出了方向：在DNA端，需要更高特异性的ctDNA富集或甲基化分选策略，以降低克隆性造血噪声；在蛋白质端，需要更灵敏的采集平台、更大体积血浆的HLA富集、以及以候选肽为中心的targeted验证。此外，术前采血、更大规模前瞻性队列，以及患者自体PBMC的免疫原性评估，都是把“原则上可行”推向“临床上可用”的必要步骤[1]。
总之，血浆免疫肽组学并非不能用于肿瘤免疫研究，只是它暂时还不能独自承担新抗原发现的任务。Riemer团队的这项预印本以清晰的数字划定了一条现实边界：血浆可以映照肿瘤的HLA呈递全貌，但要辨认出其中由突变刻下的少数几个关键字符，组织DNA与更高灵敏度的质谱方法仍是不可或缺的参照。
参考文献
- Kienzle A, Becker JP, Fendl B, Tomasich E, Heller G, Wellach K, et al. Mutanome-guided immunopeptidomics of blood plasma for neoepitope detection in solid tumors is constrained by cfDNA variant calling sensitivity and MS detection limits. bioRxiv 2026. DOI: 10.64898/2026.09.21.753080.
- Shraibman B, Nalaie A, Morozov S, et al. Identification of tumor antigens among the HLA peptidomes of glioblastoma tumors and plasma. Mol Cell Proteomics. 2018;17:2132-2145.
- Razavi P, Li BT, Brown DN, et al. High-intensity sequencing reveals the sources of plasma circulating cell-free DNA variants. Nat Med. 2019;25:1928-1937.
- Oliinyk D, Cho S, Shen C, et al. diaPASEF Analysis for HLA-I Peptides Enables Quantification of Common Cancer Neoantigens. Mol Cell Proteomics. 2025;24:100938.
- Bos M, Meijer P, van Dessel LF, et al. Whole exome sequencing of cell-free DNA – A systematic review and Bayesian individual patient data meta-analysis. Cancer Treat Rev. 2020;83:101951.
- Marcu A, Bichmann L, Kowalewski DJ, et al. HLA Ligand Atlas: a benign reference of HLA-presented peptides to improve T-cell-based cancer immunotherapy. J Immunother Cancer. 2021;9:e002071.
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